Набор для определения апоптотических клеток с помощью аннексина V-AF488

Аннексин V (или Аннексин A5) принадлежит семейству кальций- и фосфолипидсвязывающих внутриклеточных белков. Способность селективно связываться с фосфатидилсерином (ФС) позволила использовать аннексин V для выявления апоптотических клеток на ранней стадии апоптоза. Это обусловлено тем, что в норме ФС изолирован внутри клетки на цитоплазматической поверхности плазматической мембраны и других внутренних мембранах, но апоптотические изменения клеточной поверхности приводят к его экстернализации. Это делает доступным связывание аннексина V с ФС. Для визуализации процесса методами флуоресцентной микровскопии или проточной цитометрии используется аннексин V, конъюгированный с различными флуорофорами.

Аннексин V-AF 488 конъюгат – лиофилизированная форма белка, конъюгированного с сульфированным родамином AF 488 – ярким, фотостабильным зеленым флуорофором. Для анализа апоптотической активности рекомендуется использовать концентрации аннексина V-AF488 – от 2 до 5 мкг/мл, в зависимости от исследуемой клеточной культуры. Рабочий раствор красителя готовят путем разведения 5 мкг Аннексин V-AF488 в 250 мкл деионизованной воды, затем добавляют 2-5 мкл готового раствора к 100 мкл клеточной суспензии, содержащей 1×10⁵ – 1×10⁶ клеток/мл.
Окрашивание клеток аннексином V-AF 488 не позволяет дифференцировать популяции апоптотических и некротических клеток. Для этого требуется дополнительное окрашивание ядерными красителями, такими как пропидий йодид (PI), не способными проникать в еще живые клетки.

Набор для определения апоптотических клеток с помощью аннексина V-AF488 содержит в составе пропидий йодид. Это красный флюоресцентный интеркалирующий краситель для визуализации ядра и других ДНК-содержащих органелл. Неповрежденная клеточная мембрана непроницаема для PI, но на поздних этапах апоптоза или при некротических изменениях клеточных структур краситель способен проникать внутрь клетки и связываться с ДНК путем интеркаляции между парами азотистых оснований. Рекомендуемая концентрация PI: 5 мкл на 100 мкл клеточной суспензии, содержащей 1×10⁵ – 1×10⁶ клеток/мл.
В совокупности совместное окрашивание клеток с помощью аннексина V-AF488 и PI позволяет дифференцировать популяции здоровых (Annexin−PI−), апоптотических (Annexin+PI−) и некротических (Annexin+PI+) клеток.

Состав набора:

• 21515 – аннексин V-AF 488 конъюгат – 5 мкг
• 19010 – йодистый пропидий, водный раствор, 0,1 мг/мл – 100 мкл
• 83215 – буфер для связывания аннексина V, 5х – 15 мл.

Технические характеристики:

• Длины волн возбуждения/флуоресценции (AF488): 495 нм/519 нм
• Длины волн возбуждения/флуоресценции PI в несвязанном состоянии: 493/636 нм.
• Длины волн возбуждения/флуоресценции PI в связанной с ДНК формой: 535нм/617 нм

Применение: конфокальная микроскопия, проточная цитометрия.