Набор для пространственной транскриптомики FFPE-образцов

Технология стереосеквенирования (Stereo-seq) — это передовой метод пространственной транскриптомики, который позволяет визуализировать и количественно оценить экспрессию генов в контексте целого кусочка ткани, сохраняя его структуру. Ключевое отличие Stereo-seq заключается в использовании чипа, покрытого миллиардами ДНК-наношариков (DNB), каждый из которых содержит уникальную пространственную «метку» (CID). Эта технология позволяет достичь наноразмерного разрешения и охватывать большие площади образца.

Решение Stereo-seq OMNI Transcriptomics for FFPE Solution V1.1 предназначено для исследования пространственной транскриптомики из образцов, фиксированных формалином и залитых в парафин (FFPE). Технология Stereo-seq OMNI позволяет одновременно получать данные об экспрессии генов на уровне отдельных клеток и детальную гистологию.

Ключевые преимущества Stereo-seq OMNI Transcriptomics for FFPE Solution V1.1:

• Высокая чувствительность — усовершенствованная химия обеспечивает высокую эффективность захвата мРНК, увеличивая число выявляемых генов в расчёте на одну клетку.
• Сохранение пространственной структуры — истинное разрешение на уровне отдельных клеток с поддержкой мультиплексирования нескольких образцов на одном чипе.
• Гибкость — доступны чипы двух размеров: 0,5×0,5 см и 1×1 см.
• Готовое ПО STOmics для анализа и визуализации результатов — Stereo-seq Analysis Workflow (SAW) позволит сопоставить прочтения с их пространственным расположением на срезе ткани, а затем интерактивно отобразить результаты в программе визуализации StereoMap.

Стадии стереосеквенирования FFPE-образцов

Этап 1. Подготовка образцов

Подготовка и фиксирование FFPE-срезов на чипе Stereo-Chip Slide. Имеется 2 варианта размера чипов: 0,5 см x 0,5 см или 1 см x 1 см.

Этап 2. Окрашивание и визуализация

Для сохранения пространственного контекста ткань фиксируется и окрашивается для визуализации под микроскопом. Это позволяет получить гистологическое изображение, с которым позже будут сопоставлены данные секвенирования.

• Флуоресцентная микроскопия: используется краситель для одноцепочечной ДНК для окрашивания ядер.
• Световая микроскопия: используется классический метод H&E (гематоксилин и эозин).

Этап 3. Пермеабилизация, захват мРНК и синтез кДНК

Тканевый срез пермеабилизируется на чипе. Этот процесс делает клеточные мембраны проницаемыми и позволяет молекулам мРНК высвободиться из ткани и попасть на поверхность чипа с иммобилизированными на его поверхности пространственно-меченными зондами. Высвобождённая мРНК гибридизуется с олиго-dТ зондами, закрепленными на чипе. Каждый такой зонд также содержит уникальную молекулярную метку (UMI) для точного подсчёта молекул и пространственный баркод (CID), идентифицирующий его местоположение. Затем прямо на чипе проводится обратная транскрипция, в ходе которой синтезируется кДНК.

На этом этапе используется набор реагентов Stereo-seq OMNI Transcriptomics FFPE Set for Chip-on-a-slide V1.1.

Этап 4. Подготовка библиотеки для секвенирования

Полученная кДНК высвобождается с чипа и используется для создания NGS-библиотеки. Для этого применяются стандартные для MGI процессы: фрагментация ДНК, лигирование адаптеров и циркуляризация. Все реагенты для осуществления данного этапа содержатся в наборе Набор реагентов Stereo-seq 16 Barcode Library Preparation Kit.

Этап 5. Секвенирование

Готовые библиотеки секвенируются на платформах DNBSEQ-T7, DNBSEQ-T7+ или DNBSEQ-G400 в режиме PE75 с использованием специализированных наборов PE75 Stereo-seq Visualization Reagent set.

Этап 6. Анализ данных и визуализация

Полученные данные обрабатываются в 2 этапа с использованием программного обеспечения STOmics:

• SAW (Stereo-seq Analysis Workflow): пайплайн на основе командной строки Linux. Он выполняет выравнивание ридов и картирование последовательностей с их пространственными координатами на срезе ткани.
• StereoMap: десктопное приложение (совместимо с Windows/MacOS) для интерактивной визуализации результатов. Позволяет накладывать карты экспрессии генов на гистологическое изображение ткани, полученное на этапе окрашивания.