Митохондриальный индикатор перекисного окисления липидов MitoCLox

Митохондрии – один из основных источников активных форм кислорода (АФК) в клетке. АФК способны инициировать процесс перекисного окисления липидов (ПОЛ), который протекает в клеточных мембранах и имеет цепной свободнорадикальный механизм. Внутренняя мембрана митохондрий высоко чувствительна к ПОЛ, которое вызывает дисфункцию дыхательных ферментов и повышение неселективной проницаемости мембраны.

Центральную роль в ПОЛ внутренней мембраны митохондрий играет кардиолипин – фосфолипид, который составляет до 20% всех липидов внутренней мембраны митохондрий и является одним из ключевых факторов, модулирующих функции белков дыхательной цепи. Содержание ненасыщенных жирных кислот в кардиолипине значительно выше, чем в других фосфолипидах, что делает его особенно чувствительным к окислению при различных стрессовых воздействиях. Молекула кардиолипина несет отрицательный заряд, обусловливающий ее способность к образованию комплекса с цитохромом С. Последний проявляет пероксидазную активность, способствуя дальнейшему окислению кардиолипина. Окисленный кардиолипин, в свою очередь, опосредует высвобождение проапоптотических факторов и может служить маркером ранней стадии апоптоза.

Для селективной количественной оценки перекисного окисления кардиолипина митохондрий в условиях in vivo используются флуоресцентные зонды, в общем плане состоящие из диенсодержащего фрагмента (чувствительного к окислению), BDP (флуорофора с линкером) и TPP+ (трифенилфосфониевого катиона), например, MitoPerOx и MitoCLox.

MitoCLox состоит из флуорофора BDP 581/591, несущего диенсодержащий мотив (C11), который связан с остатком трифенилфосфония (TPP) через длинный гибкий линкер с двумя амидными связями. MitoCLox похож по структуре на MitoPerOx, но в отличие от него имеет более длинный линкер и содержит две (а не одну, как в MitoPerOx) пептидные связи. Гибкий линкер MitoCLox имитирует пептид SS-20 (Phe-D-Arg-Phe-Lys-NH2), что делает данный индикатор специфичным для кардиолипина. Линкер также увеличивает клеточную проницаемость MitoCLox благодаря дополнительным положительным зарядам на нем.
Окисление диенового фрагмента BDP 581/591 происходит при взаимодействии с перекисными липидными радикалами и сопряжено с повышением флуоресценции в красной области при 520 нм и снижением его исходной флуоресценции при 590 нм. Таким образом, окисление MitoCLox может быть измерено либо как снижение поглощения при 588 нм, либо как увеличение эмиссии флуоресценции в ратиометрическом режиме при 520/590 нм.
MitoCLox накапливается в митохондриях живых клеток. Максимальное его содержание в клетках достигается через 45-60 мин после добавления индикатора в среду. После удаления MitoCLox из среды флуоресценция клеток медленно снижается и достигает 50% от максимума примерно через 1 час. Рекомендуемая рабочая концентрация MitoCLox составляет 100-200 нМ.

Технические характеристики:

• Молекулярная формула: C₅0H₅₃BBrF₂N₄O₂P
• Молекулярная масса: 901.69
• Растворимость: ДМСО
• Контроль качества: ЯМР 1H и ВЭЖХ-МС (95+%)