LumiCell Reticulocyte Stain

Ассиметричные цианиновые красители традиционно используются в качестве флуоресцентных зондов для детекции нуклеиновых кислот. Это обусловлено рядом характерных особенностей данной группы соединений:

• молекула состоит из двух различных гетероциклических субъединиц, соединенных одной или несколькими мостиковыми метиновыми связями, что обусловливает способность к внутримолекулярным торсионным движениям, ограничивающим флуоресценцию в несвязанном состоянии;
• связывание с нуклеиновыми кислотами (НК) осуществляется путем интеркаляции в их двухцепочечные структуры или посредством связывания с малой бороздкой ДНК;
• в связанном состоянии молекулы цианиновых красителей приобретают планарную структуру, что способствует многократному увеличению флуоресценции.

Тиазоловый оранжевый (ТО) – флуоресцентный асимметричный цианиновый краситель, молекула которого состоит из двух гетероциклических структур (хинолиновой и бензотиазольной), соединенных метиновым мостиком. ТО характеризуется крайне низким квантовым выходом флуоресценции в маловязких растворителях. Интенсивность флуоресценции зависит от конформации молекулы красителя. Планарная конформация с сопряжением между двумя ароматическими системами – флуоресцентная форма ТО, которая возникает при связывании с нуклеиновыми кислотами; свободно вращающиеся на метиновом мостике бензотиазольный и хинолиновый гетероциклы образуют непланарную конформацию, которая не флуоресцирует в несвязанном состоянии.
ТО в равной степени может интеркалировать в двухцепочечные/дуплексные структуры нуклеиновых кислот и связываться с малой бороздкой ДНК, что делает его эффективным витальным красителем ядерных структур живых клеток и позволяет использовать для визуализации ДНК и РНК в гель-электрофорезе. Кроме того, ТО способен флуоресцировать с высоким квантовым выходом при связывании с макроциклами, мицеллами и G-квадруплексами ДНК. Может использоваться для окрашивания живых грамположительных и грамотрицательных бактерий, дрожжей. В последнем случае ТО локализуется в равной степени в ядре и цитоплазме; после фиксации окрашивание становится полностью цитоплазматическим. В живых клетках млекопитающих ТО сначала окрашивает митохондрии, а затем перераспределяется в ядро и цитоплазму.

Впервые краситель был предложен для обнаружения ретикулоцитов с помощью проточной цитометрии, заменив более слабые и менее чувствительные красители: акридиновый оранжевый и тиофлавин-Т.
Ретикулоциты – незрелые эритроциты, образующиеся в костном мозге из клеток-предшественников нормобластов. Увеличение или уменьшение количества ретикулоцитов может указывать на активность эритропоэза и нарушения, связанные с анемиями и дисфункцией костного мозга.
Характерной особенностью ретикулоцитов является наличие в цитоплазме зернисто-нитчатых образований из агрегированных рибосом и митохондрий. Эти образования представлены рибосомальной РНК и выявляется при суправитальной окраске. При этом у ретикулоцитов разных стадий зрелости они отличается полиморфизмом: у самых молодых ретикулоцитов РНК-содержащая субстанция обильная и имеет форму густого клубка, а в более зрелых клетках она выявляется в виде сеточки, отдельных нитей, зерен.
Окрашивание препаратов крови тиазоловым оранжевым позволяет не только выявлять структуру РНК-содержащих образований в ретикулоцитах и отличать их тем самым от зрелых эритроцитов, но и дифференцировать стадию их созревания.

Примечательно, что ни один из используемых ранее витальных ядерных красителей не демонстрировал при окрашивании ретикулоцитов эффективность, равную ТО: акридиновый оранжевый имеет менее чем 5-кратное усиление флуоресценции при связывании с РНК – визуализация ретикулоцитов с крайне низким разрешением; тиофлавин Т демонстрирует 100-кратное усиление флуоресценции при связывании с РНК и дает хорошее разрешение при анализе ретикулоцитов, однако характеризуется низким квантовым выходом связанного красителя, что может потребовать двухэтапной процедуры окрашивания: для получения точных результатов нуклеиновая кислота должна быть насыщена красителем.
Насыщение РНК тиазоловым оранжевым достигается при соотношении 1 молекула красителя к 10 парам оснований, а насыщение ДНК – при соотношении 1 молекула красителя к 2 парам оснований. При использовании тиофлавина Т подобный эффект не достигался даже при соотношении красителя к паре оснований – 2 к 1 для ДНК и 1 к 1 – для РНК.
LumiCell Reticulocyte Stain представляет собой готовый к использованию раствор тиазолового оранжевого для определения процентного содержания ретикулоцитов в периферической крови человека с помощью микроскопии и проточной цитометрии.

Технические характеристики:

• Молекулярная формула: C₁₉H₁₇IN₂S
• Молекулярная масса: 432.33
• Контроль качества: ЯМР ¹H и ВЭЖХ-МС (95+%)
• Максимум возбуждения/ флуоресценции: 509 нм/532 нм

Применение: флуоресцентная микроскопия, проточная цитометрия.